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HPLC中的加样回收率试验怎么做呢?有几种方法  

2009-06-10 12:19:31|  分类: 液相色谱 |  标签: |举报 |字号 订阅

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HPLC中的加样回收率试验怎么做呢?有几种方法 - 液相色谱柱流动相...
14条评论 HPLC中的加样回收率试验怎么做呢?有几种方法,液相色谱柱流动相内标优化的网易博客,寻医问药:事缓则圆:急于称赞而迟于寻错,诚于嘉许又宽于待人 液相色谱柱流动.blog.163.com/med0/.. 2011-7-5 - 百度快照

 

05版药典中提供两种方法,这里就不说了,看药典 

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现在一般都用第二种方法,又分两种添加方法:
1 添加样品中含量一半的80%、100%和120%,每个两份
2 添加样品中含量一半的50%、100%和150%,每个两份。这两种都可以的
计算时添加后测得的含量与原来样品的含量一半之差作分子,添加的含量做分母,并计算这6个结果的RSD,小于3%即可。

关于加样回收率的讨论已有报道[1-3],虽对加样回收率的两种计算方 法均从不同侧面做了较透彻的讨论与选择,但均忽略了原样品(实际样品)中待测组分含量确定的 方法及其误差性质对回收率结果可靠性的影响,有必要做进一步的探讨作为补充。设原样品中待测 组分的真实量为Xo,待测组分纯品标准加入的真实量为Yo,为统一讨论,我们把Yo的获得及 加入过程也看为一种测量,那么,Xo、Yo及其总量的测得量分别为X、Y和Z,它们的测量误 差分别为EX、EY和EZ,则目前回收率R有如下两种计算方法依据测得Xo的方法不同分以下 两种情况讨论。

1成熟方法包括药典法及可靠的文献法。

由于选用的方法成熟可靠,测量误差小, 则EX可忽略,而且Yo的获得及加入过程一般是可靠的,Ey亦可忽略,则(1)、(2)式可 分别简化为(3)、(4)式:两式中,R唯一地与测量误差EZ相关,理论上讲,可以用来检验 拟订方法的准确度。2拟订方法同上讨论,Ey可以忽略,但由于X0是按拟订方法测得的,故E X不可盲目忽略,则(1)、(2)式可分别简化为(5)、(6)式:R并不唯一地与EZ相关 ,还与测定原样品中Xo的误差EX有关,是否可以用来检验拟订方法的准确度需要做进一步的讨 论。测量误差按其性质分为两类:偶然误差和系统误差,系统误差又包括恒定误差和比例误差。偶 然误差可以通过增加试验次数来消除,本文不做更深讨论,而系统误差却会给测定带来固定方向的 偏差。

2.1系统误差为恒定误差:此时EX=EZ,所以(5)、(6)式可写为(7)、(8 )式:即在该情况下,无论拟订方法的误差多大,回收率均为100%。结果显然是不可靠的。

2 .2系统误差为比例误差:设比例误差的比例系数为E,则EX=E·Xo,EZ=E·(Xo+ Yo),则(5)、(6)式可分别写成(9)、(10)式:回收率的实质是单位真实量的测得 量,而E是单位真实量的测量误差,所以R应等于1+E,此时,用(9)式计算回收率是可靠的 ,而用(10)式计算,R随Xo/(Xo+Yo)的值变化而变化,当且仅当Xo/(Xo+Y o)=0,即Xo=0或Yo为无穷大时,R=1+E。但前者回收率试验实质上已是模拟样品回 收率,而后者已变为纯品回收率试验,均不在本文讨论范围之内。上面讨论的是两种极端情况,而 在实际工作中,测量误差既包括恒定误差,又包括比例误差,文献认为:“仪器由于灵敏度等原因 ,测量一般为恒定误差,而方法误差也不全为比例误差,”另外,由于操作者造成的误差也往往表 现为恒定误差,如对滴定终点指示剂变色的判断等。这说明目前定量研究的误差多属恒定误差,所 以用拟订方法测定原样品中待测组分的含量后计算回收率的方法并不可靠。因此,虽然目前绝大多 数药物分析工作者在做加样回收率计算时均使用(1)式,认为测得总量减去原样品测得量后即可 消除原样品中待测组分含量及其测量误差的影响,但却未考虑到并非所有情况下均适用,反而会因 此获得一个不真实的回收率,错误判断拟订方法的准确度。例:我们把某一测定方法假设为一根容 量足够大的刻度吸量管,首先我们假设它有恒定误差,它的Oml刻度处实为10ml,其余部分 准确,即本吸量管有一10ml的恒定误差,下面结合上述讨论对该吸量管(即某一测定方法)的 准确度做一个检验。设X0=20ml,Y0=10ml,则EZ=-10ml。如用(3)、( 4)式计算:(3)R=1+(-10)/10=0%(4)R=1+(-10)/(20+10 )=67%如用(5)、(6)两式计算:(5)R=[10+(-10)-(-10)]/10 =100%(6)R=(20+10)+(-10)/20+10+10=100%由上可见,对 于一个设定的明显有很大误差的测定方法,用拟订方法测定X0后计算却得出了“理想”的回收率 数据,可见如此计算在测定存在恒定误差的情况下是不可靠的;而用成熟方法测定X0后,均得出 方法不准确的结论,但用两式计算,结果明显不同,我们认为造成这一现象的原因是对于每次测定 来说,由于误差恒定,(3)式把本应该由整个测定样品负担的误差均加在了测定样品的一部分, 即Y0上,导致相对误差增大,也因此用(4)式计算比前者相对误差小,更接近100%(无论 EZ的正与负);同时,我们还可发现当Y0变化时,R也在不断变化,那么,虽然从数学的角度 来看,(4)式的计算是合理的,但到底加入量y0为多少时及选择哪种计算方法回收率计算的结 果是可靠的呢?关于加样回收率试验中Y0为多少合适尚无统一说法,相对于原样品取量中待测组 分的含量,Y0为其几分之一至数倍的都有,从设计方法上考虑,有的是数份回收率试验中均加入 统一量的Y0,有的是Y0各不相同并形成一个梯度差,也有的Y0相同而原样品的取量不同等等 ,并且的确由于加样量不同得到了不同的回收率结果。我们认为在某个拟订方法的操作中,原样品 的质量及其取样量是相对恒定的,那么该方法应存在一个“实际回收率”,即实际工作中,对样品 中的X。用拟订方法测得X后,X/X0的值,做为上例中的样品,X0=20ml,EZ=10 ml,那么“实际回收率”就应为[20+(-10)]/20=50%,这是最具有实际意义的 数据,所以,无论加样量为多少或何种计算方法,回收率能够达到这一数据的即是正确的加样量及 正确的计算方法,由此计算出的数据就是可靠的数据。对于(4)式,Yo无论多大,R总是以5 0%为起点(即以1+EZ/Xo为起点),随Y0的增大,R无限接近100%,显然不能选择 这种计算方法,更无从谈及加样量的问题;而用(3)式计算,R以负无穷大为起点(即以1+E Z/Yo为起点),随Yo的增大,R无限接近100%,当Yo=Xo时,R=50%,恰好与 “实际回收率”相等。所以,当测量误差为恒定误差时,应选用(3)式计算,Yo应同原样品中 待测组分的含量相等或接近。如果Yo小于原样品的含量,会夸大其误差,可能导致拟订方法失败 的结论,而如果随意加大Yo,也可能会掩盖拟订方法的误差,给将来的进一步工作埋下隐患,两 种情况下均会得到不可靠的回收率数据,应尽量避免。关于该吸量管为比例误差的情况可如上设定 讨论,此不赘述。此时用(4)式或(9)式计算,结果是相同的,而对于纯品加入量Y0要求不 很严格,只是不宜大小。

结果。我们认为在某个拟订方法的操作中,原样品的质量 及其取样量是相对恒定的,那么该方法应存在一个“实际回收率”,即实际工作中,对样品中的X 。用拟订方法测得X后,X/X0的值,做为上例中的样品,X0=20ml,EZ=10ml, 那么“实际回收率”就应为[20+(-10)]/20=50%,这是最具有实际意义的数据, 所以,无论加样量为多少或何种计算方法,回收率能够达到这一数据的即是正确的加样量及正确的 计算方法,由此计算出的数据就是可靠的数据。对于(4)式,Yo无论多大,R总是以50%为 起点(即以1+EZ/Xo为起点),随Y0的增大,R无限接近100%,显然不能选择这种计 算方法,更无从谈及加样量的问题;而用(3)式计算,R以负无穷大为起点(即以1+EZ/Y o为起点),随Yo的增大,R无限接近100%,当Yo=Xo时,R=50%,恰好与“实际 回收率”相等。所以,当测量误差为恒定误差时,应选用(3)式计算,Yo应同原样品中待测组 分的含量相等或接近。如果Yo小于原样品的含量,会夸大其误差,可能导致拟订方法失败的结论 ,而如果随意加大Yo,也可能会掩盖拟订方法的误差,给将来的进一步工作埋下隐患,两种情况 下均会得到不可靠的回收率数据,应尽量避免。关于该吸量管为比例误差的情况可如上设定讨论,此不赘述。此时用(4)式或(9)式计算,结果是相同的,而对于纯品加入量Y0要求不很严格,只是不宜大小。

 

关于药物定量分析中加样回收率实验的再探讨 

回收率包括绝对回收率和相对回收率。绝对回收率考察的是经过样品处理后能用于分析的药物的比例。因为不论是生物基质还是制剂辅料中的药物,经过样品处理都有一定的损失。做为一个分析方法,绝对回收率一般要求大于50%才行。它是在空白基质中定量加入药物,经处理后与标准品的比值。标准品为流动相直接稀释而来,而不是同样品一样处理。若一样,只是不加基质来处理,可能会有很多影响因素被此屏蔽掉。如全部转移有机相时只转移了98%等。也就因此失去了绝对回收率的考察初衷。
  相对回收率严格来说有两种。一种是回收试验法,一种是加样回收试验法。前者是在空白基质中加入药品,标准曲线也是同此,这种测定用得较多,但有标准曲线重复测定的嫌疑。第二种是在已知浓度样品中加入药物,来和标准曲线比,标准曲线也是在基质中加药物。相对回收率主要考察准确度。
准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度。有时也称真实度。 一定的准确度为定量测定的必要条件,因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证准确度,如含量测定、杂质定量试验等。 准确度应在规定的范围内建立,对于制剂一般以回收率试验来进行验证。试验设计需考虑在规定范围内,制备3个不同浓度的试样,各测定3次,即测定9次,报告已知加入量的回收率(%)或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。
  1.含量测定 原料药可用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定,或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。 制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分,可向制剂中加入已知量的被测物进行测定,必要时,与另一个已建立准确度的方法比较结果。一般制剂的含量测定的回收率是向辅料中加入处方量80%、100%、120%已知含量的主药,按含量测定的方法测定。溶出度测定方法的回收率按处方量50%、80%、100%加入主药进行测定。
  2.杂质定量试验 杂质的定量试验可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质,可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较,如药典方法或经过验证的方法。 如不能测得杂质的相对响应因子,可在线测定杂质的相关数据,如采用二极管阵列检测器测定紫外光谱,当杂质的光谱与主成分的光谱相似,则可采用原料药的响应因子近似计算杂质含量(自身对照法)。并应明确单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比(%)或面积比(%)。
 

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